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                    歡迎光臨上海懋康生物科技有限公司
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                    技術文章
                    農桿菌介導的植物轉化方法(農桿菌感受態細胞)

                    轉基因植物研究農桿菌轉化法(Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation):

                     

                    根癌農桿菌感受態細胞(EHA101,EHA105,LBA4404,GV3101,AGL1)

                    發根農桿菌感受態細胞(MSU440,C58C1,K599,Ar A4,Ar.Qual,Ar 1193)

                     

                    農桿菌介導的植物轉化方法(僅作交流學習用)

                    實驗目的:

                    根癌農桿菌介導的擬南芥轉化實驗(來自網絡資料)

                    驗原理:

                    農桿菌對雙子葉植物的創傷部位侵染廣泛,在某些條件下對單子葉植物也有一定的感染性。

                    根癌農桿菌含有Ti 質粒,Ti質粒上的T-DNA在Vir區(virulence region)基因產物的介導下可以插入到植物基因組中,誘導在宿主植物中瘤狀物的形成。因此,將外源目的基因插入到T-DNA  中,借助Ti質粒的功能,使目的基因轉移進宿主植物中并進一步整合、表達。

                    實驗材料:

                    重組雙元表達載體pCAMBIA1300 ,GV3101農桿菌感受態細胞,擬南芥

                    實驗試劑:

                    浸染液:1/2MS,1×B5維生素,5%蔗糖,50ml/L Silwet L-77, 0.044mM 6-芐氨基嘌呤(6-BA)(10ml/L of 1 mg/ml stock in DMSO) 。 或使用只加入5%蔗糖和50-500ul/L Silwet L-77的水溶液作為浸染液。

                    實驗步驟:

                    1. 擬南芥的培養

                    將擬南芥種子經10%雙氧水消毒后接種于MS培養基上,于22℃、光照10h培養1-2周,長出無菌苗后轉移至坧石和土(3:1)混合物上培養?!咀⒁猓簼穸纫笠恍?/span>

                    2. 成功轉化雙元載體的農桿菌GV3101懸浮液(對數生長期)

                    將目的基因構建到雙元載體上,之后,將重組的雙元載體轉入農桿菌GV1301并用卡那霉素(50mg/ml)篩選含有重組雙元載體的菌落。將農桿菌接種在LB 液體培養基(含有慶大霉素25mg/L用于篩選Ti質粒,卡那霉素50mg/L 用于篩選T-DNA)中,28℃,180r/min條件下震蕩培養至對數生長期,T-DNA 28℃,180r/min 在4℃和-20℃分別保存菌株備用。

                    3. 農桿菌感染擬南芥

                    3.1 在轉化前三天,接種含有雙元載體的農桿菌到5ml含有抗生素(慶大霉素20mg/L,卡那霉素50mg/L)的LB液體培養基中,28℃下震蕩培養2天。

                    3.2 兩天后,將1ml培養的農桿菌轉移到100ml含有抗生素的 LB液體培養基中,28℃繼續震蕩培養24h。(前面步驟由實驗技術人員準備:保證每組有約80ml-100ml 的農桿菌,事先分裝到兩個50ml的離心管中。)

                    3.3 將農桿菌轉入離心管中,6000rpm/min,室溫條件下, 離心10min,然后將上清倒出。

                    3.4 將沉淀用200ml浸染液重懸,形成均勻的農桿菌懸浮液 (OD600=0.8左右),并將農桿菌懸浮液轉移到一個敞口的器皿中(500ml燒杯)。

                    3.5 選取初果期的健壯植株,帶盆缽一起倒扣于盛有農桿菌懸浮液的容器上方,將整個花序浸入上述農桿菌懸浮液中約20-30s,注意葉片盡量不與浸染液接觸。同一個燒杯中的農桿菌懸浮液可以轉化10株或者更多株擬南芥。

                    3.6 將盆缽取下,橫放于暗箱中約24h。注意保持一定的濕度。

                    3.7 24h后將處理過的擬南芥植株放于22~25℃的光照條件下使其正常生長。

                    3.8 大約三周后收取成熟種子。

                    4. 注意事項

                    4.1 在箱底撒水保濕,然后將花盆平放到箱子中,并用塑料袋罩住箱子暗培養16-24h(過夜)后,將擬南芥放置于塑料培養池內,并澆足Horgland營養液,恢復正常培養。

                    4.2 為了提高轉化率,去除塑料袋3天后,用吸管吸取適量重懸目的質粒的新鮮轉化液,逐個醮沾花蕾。

                    4.3 轉化后擬南芥的培養恢復正常管理,一旦再出現側蘗或主苔出現分枝,及時剪除。

                    4.4 轉化5-6周后,為了加速擬南芥成熟可以適量少澆營養液。待擬南芥個別角果開始枯黃后,可將其角果剪下放于培養皿內干燥。擬南芥角果大部分。

                    4.5 枯黃后,即可收取全部種子存于1.5ml 的EP管中(在蓋上扎一小孔以便干燥)。種子*干燥后,放于1.5ml 新EP管中4℃短期保存。如需要可放于-20℃冰箱內長期保存。 

                     

                    產品信息:我司(上海懋康生物)提供一系列農桿菌介導的轉基因植物研究用產品,從雙元載體(binary vectors),到農桿菌感受態細胞(competent cells),到常用植物培養基,到植物生長調節劑/誘導劑,到轉化篩選用的抗生素,所有產品現貨供應,專為植物研究人員而設計。如果你需要更多關于產品或實驗相關的問題,咨詢。

                    一、常用的植物雙元表達載體

                    貨號

                    名稱

                    規格           

                    目錄價(元) 

                    載體抗性             

                    篩選標記           

                    MF3701-5UG    

                    pCAMBIA1300 Vector       

                    5μg

                    1200

                    卡那霉素Kan

                    潮霉素HygR

                    MF3702-5UG

                    pCAMBIA1301 Vector

                    5μg

                    1200

                    卡那霉素Kan

                    潮霉素HygR

                    MF3703-5UG

                    pCAMBIA1305.1 Vector

                    5μg

                    1500

                    卡那霉素Kan

                    潮霉素HygR

                    MF3704-5UG

                    pCAMBIA1305.2 Vector

                    5μg

                    1500

                    卡那霉素Kan

                    潮霉素HygR

                    MF3706-5UG

                    pCAMBIA2300 Vector

                    5μg

                    1200

                    卡那霉素Kan

                    新霉素Neo

                    MF3707-5UG

                    pCAMBIA2301 Vector

                    5μg

                    1200

                    卡那霉素Kan

                    新霉素Neo

                    MF3721-5UG

                    pBI121Vector

                    5μg

                    1500

                    卡那霉素Kan

                    新霉素Neo

                    MF3722-5UG

                    pBI121-EGFP Vector

                    5μg

                    1500

                    卡那霉素Kan

                    新霉素Neo

                    MF3724-5UG

                    pBI221 Vector

                    5μg

                    1450

                    氨芐青霉素Amp

                    /

                    MF3725-5UG

                    pBI221-EGFP Vector

                    5μg

                    1200

                    氨芐青霉素Amp

                    /

                    MF3731-5UG

                    pRI101-AN Vector

                    5μg

                    2000

                    卡那霉素Kan

                    遺傳霉素NPT II

                     

                    二、常用的根癌農桿菌感受態細胞

                    貨號

                    名稱

                    規格

                    目錄價(元)       

                    農桿菌類型         

                    MF2301-1000UL    

                    EHA101化學感受態細胞            

                    10×100μl          

                    280

                    根癌農桿菌

                    MF2301-5000UL

                    EHA101化學感受態細胞

                    50×100μl

                    1220

                    根癌農桿菌

                    MF2302-1000UL

                    EHA105化學感受態細胞

                    10×100μl

                    280

                    根癌農桿菌

                    MF2302-5000UL

                    EHA105化學感受態細胞

                    50×100μl

                    1220

                    根癌農桿菌

                    MF2303-1000UL

                    LBA4404化學感受態細胞

                    10×100μl

                    280

                    根癌農桿菌

                    MF2303-5000UL

                    LBA4404化學感受態細胞

                    50×100μl

                    1220

                    根癌農桿菌

                    MF2304-1000UL

                    GV3101化學感受態細胞

                    10×100μl

                    280

                    根癌農桿菌

                    MF2304-5000UL

                    GV3101化學感受態細胞

                    50×100μl

                    1220

                    根癌農桿菌

                    MF2305-1000UL

                    AGL1化學感受態細胞

                    10×100μl

                    280

                    根癌農桿菌

                    MF2305-5000UL

                    AGL1化學感受態細胞

                    50×100μl

                    1220

                    根癌農桿菌

                    MF2306-1000UL

                    EHA101電轉感受態細胞

                    10×100μl

                    600

                    根癌農桿菌

                    MF2306-5000UL

                    EHA101電轉感受態細胞

                    50×100μl

                    2400

                    根癌農桿菌

                    MF2307-1000UL

                    EHA105電轉感受態細胞

                    10×100μl

                    600

                    根癌農桿菌

                    MF2307-5000UL

                    EHA105電轉感受態細胞

                    50×100μl

                    2400

                    根癌農桿菌

                    MF2308-1000UL

                    LBA4404電轉感受態細胞

                    10×100μl

                    600

                    根癌農桿菌

                    MF2308-5000UL

                    LBA4404電轉感受態細胞

                    50×100μl

                    2400

                    根癌農桿菌

                    MF2309-1000UL

                    GV3101電轉感受態細胞

                    10×100μl

                    600

                    根癌農桿菌

                    MF2309-5000UL

                    GV3101電轉感受態細胞

                    50×100μl

                    2400

                    根癌農桿菌

                    MF2310-1000UL

                    AGL1電轉感受態細胞

                    10×100μl

                    600

                    根癌農桿菌

                    MF2310-5000UL

                    AGL1電轉感受態細胞

                    50×100μl

                    2400

                    根癌農桿菌

                     

                    三、常用的發根農桿菌感受態細胞

                    貨號

                    名稱

                    規格

                    目錄價(元)      

                    農桿菌類型           

                    MF2451-1000UL     

                    MSU440化學感受態細胞            

                    10×100μl        

                    430

                    發根農桿菌

                    MF2451-5000UL

                    MSU440化學感受態細胞

                    50×100μl

                    1830

                    發根農桿菌

                    MF2453-1000UL

                    C58C1化學感受態細胞

                    10×100μl

                    430

                    發根農桿菌

                    MF2453-5000UL

                    C58C1化學感受態細胞

                    50×100μl

                    1830

                    發根農桿菌

                    MF2455-1000UL

                    K599化學感受態細胞

                    10×100μl

                    430

                    發根農桿菌

                    MF2455-5000UL

                    K599化學感受態細胞

                    50×100μl

                    1830

                    發根農桿菌

                    MF2457-1000UL

                    Ar A4化學感受態細胞

                    10×100μl

                    430

                    發根農桿菌

                    MF2457-5000UL

                    Ar A4化學感受態細胞

                    50×100μl

                    1830

                    發根農桿菌

                    MF2459-1000UL

                    Ar Qual化學感受態細胞

                    10×100μl

                    430

                    發根農桿菌

                    MF2459-5000UL

                    Ar Qual化學感受態細胞

                    50×100μl

                    1830

                    發根農桿菌

                    MF2461-1000UL

                    Ar 1193化學感受態細胞

                    10×100μl

                    430

                    發根農桿菌

                    MF2461-5000UL

                    Ar 1193化學感受態細胞

                    50×100μl

                    1830

                    發根農桿菌

                    MF2452-0500UL

                    MSU440電轉感受態細胞

                    10×50μl

                    720

                    發根農桿菌

                    MF2452-2500UL

                    MSU440電轉感受態細胞

                    50×50μl

                    3000

                    發根農桿菌

                    MF2458-0500UL

                    Ar A4電轉感受態細胞

                    10×50μl

                    720

                    發根農桿菌

                    MF2458-2500UL

                    Ar A4電轉感受態細胞

                    50×50μl

                    3000

                    發根農桿菌

                    MF2460-0500UL

                    Ar 1193電轉感受態細胞

                    10×50μl

                    720

                    發根農桿菌

                    MF2460-2500UL

                    Ar 1193電轉感受態細胞

                    50×50μl

                    3000

                    發根農桿菌

                     

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